1、糞大腸菌群

糞大腸菌群是總大腸菌群中的一部分，用來(lái)表明水質(zhì)受污染的程度，主要來(lái)自糞便。糞大腸菌群是一類(lèi)能使乳糖發(fā)酵、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，在44.5 ℃培養24~48ｈ能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。通過(guò)對糞大腸菌群的監測，可了解水體受生活污水污染的狀況。糞大腸菌群適 用于河流、湖泊等地表水、企業(yè)污水及醫院廢水的監測，是綜合評價(jià)城鎮污水，尤其是生活污水污染的一個(gè)必不可少的重要指標。糞大腸菌群作為地表水環(huán)境質(zhì)量標準WY的一項微生物監測指標，我國多用多 管發(fā)酵法進(jìn)行檢測，近幾年也更新了好幾個(gè)相關(guān)環(huán)境標準。

2、樣品的采集和保存

2.1 采樣瓶的準備和存放

采集糞大腸菌群的采樣瓶需要用牛皮紙封包好后，再經(jīng)過(guò)高壓滅菌器滅菌才能使用。滅菌后的采樣瓶里如果含有少量冷凝水，可以放在烘箱里烘干。有條件的單位，也可以使用無(wú)菌采樣瓶。滅菌后的采樣瓶也有其保存期，超過(guò)兩周內未使用就必須重新滅菌。絕大部分實(shí)驗室都是在首次滅菌后不再管其使用期
限。采樣瓶存放過(guò)久可能受到雜菌污染。

2.2 樣品采集

采樣人員大多缺乏細菌學(xué)監測知識，出現很多采樣不規范的現象。如：微生物項目水樣和理化水樣混采；滅菌瓶開(kāi)蓋時(shí)間過(guò)早、水樣在空氣中暴露
時(shí) 間 過(guò) 長(cháng)；水樣采集量過(guò)滿(mǎn)（既容易導致水樣中細菌缺氧死亡，又不利于水樣檢測前振蕩搖勻）；微生物樣品和其他理化項目同時(shí)采樣時(shí)，沒(méi)有做到細菌樣品優(yōu)先采集；采樣人員在采集樣品時(shí)，沒(méi)注意避免采樣瓶受雜菌污染（手接觸到瓶蓋和瓶頸、采樣設備不規范）。

2.3 樣品運輸保存

在樣品的運輸和保存過(guò)程中，樣品的冷藏是關(guān)鍵（溫度過(guò)高過(guò)低都不利于樣品的保存）。由于儀器設備條件不夠，運輸過(guò)程不滿(mǎn)足樣品所需溫度或者路途遙遠，送檢時(shí)間超過(guò)６ｈ，都會(huì )導致樣品失效。樣品交接時(shí)間過(guò)長(cháng)（在樣品送入實(shí)驗室之后，采樣人員要將采樣記錄移交給業(yè)務(wù)室，然后由接樣員對水樣進(jìn)行編號并將檢測任務(wù)下發(fā)到監測室），導致樣品沒(méi)有及時(shí)分析而超過(guò)時(shí)限。特別是，在執法監測和污染源監督性監測中，需要的采樣時(shí)間長(cháng)，有時(shí)還需
要 分 時(shí) 間 段 監 測，這過(guò)程很容易造成樣品超時(shí)。并且，樣品保存時(shí)間越長(cháng)越不能保證樣品在合格的冷藏溫度下。這幾年，經(jīng)常出現企業(yè)和監測機構因該項目實(shí)驗的特殊性發(fā)生糾紛。建議在采集細菌樣時(shí)，車(chē)上安裝車(chē)載冰箱、冷藏箱或者其他冷藏設備，可以實(shí)時(shí)監測溫度。加入冰塊保存時(shí)，樣品不可以直接接觸冰塊。不能保證樣品在有效期內送達實(shí)驗室分析時(shí)，可以考慮使用剛剛出臺的酶底物法（HJ1001-2018）進(jìn)行現場(chǎng)檢驗。

3、 實(shí)驗室分析3.1 試劑質(zhì)量

3.1.1 無(wú)菌水

目前很多實(shí)驗室采用先配置所需量的稀釋水到試管中再統一滅菌。在實(shí)驗分析時(shí)發(fā)現由于稀釋水在高壓滅菌和冰箱存放這一系列過(guò)程中揮發(fā)，導致稀釋水在做樣時(shí)達不到所需的量。建議先用大容量玻璃瓶統一準備足量的無(wú)菌水和100ｍL的量筒，使用時(shí)在無(wú)菌環(huán)境下按所需量進(jìn)行分裝。無(wú)菌水的配制盡量在當天或實(shí)驗前一天配置，ZUI好實(shí)驗當天進(jìn)行配制。無(wú)菌水需要調pH值、可在常溫保存。

3.1.2培養基

培養基的質(zhì)量是整個(gè)實(shí)驗檢測結果的保障，是實(shí)驗室質(zhì)量控制的重要環(huán)節。分 析人員可能認為只要培養基在保質(zhì)期內，都是合格的，而忽略了對培養基進(jìn)行質(zhì)量控制。

培養基需在濕度低、溫度不超過(guò)３０ ℃的房間避光保存，避免雜菌侵入。配置前，應該觀(guān)察培養基顏色和體積，變化明顯時(shí)廢棄不用。配好的培養基需要在２ｈ內進(jìn)行高壓滅菌；對于不能及時(shí)滅菌的培養基，可以在冰箱內存放且不超過(guò)一天，因為滅菌不及時(shí)，就會(huì )影響其殺菌效果和營(yíng)養成份的含量。培養基滅
菌結束后應迅速冷卻，避免長(cháng)時(shí)間保存在滅菌鍋內，容易造成滅菌過(guò)度從而影響培養基的營(yíng)養成分。配置的培養基不宜存放過(guò)久，堅持多配少量的原則，盡 量在一周內用完為好。每批培養基在使用前，都應對培養基進(jìn)行質(zhì)量鑒定，只有經(jīng)過(guò)驗證合格的培養基，才能投入使用。

3.2 操作方法

3.2.1 稀釋倍數  

有時(shí)候，企業(yè)污水、醫療廢水等糞大腸菌群污染嚴重的水樣需要稀釋到10-4～10-5ｇ／mL之后接種，但分析人員不能準確判斷其大致稀釋倍數，容易出現超出或者低于定量范圍?，F行的環(huán)境監測分析方法與有關(guān)技術(shù)規范中糞大腸菌群檢數表里所列的幾個(gè)不定值（“＜”或“＞”）給監測工作帶來(lái)一定的困難。能否選擇出正確的稀釋度是實(shí)驗成敗的關(guān)鍵。

接種的稀釋比，為了避免在實(shí) 測 數 據 中 出 現 不 定值，實(shí)驗分析人員應充分了解自己所做區域各種水樣的稀釋比，根據待檢水樣的環(huán)境因素和水樣性質(zhì)確定合適的稀釋比。采樣人員盡量將樣品性質(zhì)、受污染程度在采樣記錄上描述清楚，以供分析人員選擇合適的分析方法。對于不確定稀釋范圍的水樣，可以進(jìn)行多種梯度稀釋。

3.2.2 結果判讀

在使用多管發(fā)酵法測試時(shí)，如果在初發(fā)酵試驗中未發(fā)現產(chǎn)氣，可以適當地延長(cháng)培養時(shí)間到48ｈ。

在使用酶底物法測試時(shí)，在培養24ｈ后結果為可疑陽(yáng)性或者無(wú)顏色反應，可 適 當 延
長(cháng) 培 養 時(shí) 間 到28ｈ進(jìn)行結果判讀，超過(guò)28ｈ之后出現的
顏 色 反 應 不 作 為陽(yáng)性結果。如果樣品有背景顏色，需做一個(gè)空白試驗，與標準盤(pán)作比較。如果加入培養基，樣品顏色過(guò)深，可能是余氯過(guò)多或者pH值過(guò)低的原因，這種方法就不適用了。

4、質(zhì)量控制

4.1 質(zhì)控措施

糞大腸菌群項目的監測起步比較早，但是之前一直作為非標項目，糞大腸菌群的質(zhì)控標準菌株也是在近兩年才興起。大部分實(shí)驗室分析人員之前沒(méi)有接觸過(guò)
質(zhì)控，也沒(méi)有接受過(guò)這方面知識的培訓，在近兩年密碼樣考核和實(shí)驗室間比對中，該項目的效果不是很好。

目前國內使用的有證標準菌株幾乎都是從國外購買(mǎi)的，價(jià)格貴、購買(mǎi)渠道復雜且不易保存。國內實(shí)驗室很少有達到對每批樣品 使 用 有 證 標
準 菌 株 進(jìn) 行 陽(yáng) 性、陰性對照試驗。微生物的質(zhì)控、盲樣制作難度較大，影響了國內實(shí)驗室關(guān)于微生物方面質(zhì)量控制的開(kāi)展。盡管如此，各個(gè)實(shí)驗室也應該盡量做到，定期使用有證標準樣品進(jìn)行質(zhì)量控制，使用有證標準菌株進(jìn)行陰陽(yáng)性對照試驗。酶底物法要求，每年至少必須進(jìn)行６次定量試驗、４次定性試驗。

4.2 空白和平行性

以前使用的多管發(fā)酵法、濾膜法等對空白和平行性沒(méi)有明確的要求。大部分實(shí) 驗室也僅限于對每批樣進(jìn)行空白測定。

無(wú)論用哪種方法檢測，建議每個(gè)月要對實(shí)驗室用水做質(zhì)量檢測，每批樣品要用無(wú)菌水做全程序空白和實(shí)驗室空白測定，確保檢測結果的準確性和可靠性。使用酶底物法分析時(shí)，對20個(gè)樣品或每批次樣品測定一個(gè)平行雙樣。